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022-66387942細(xì)胞計(jì)數(shù)是指對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量測定的方法。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定細(xì)胞培養(yǎng)的密度和數(shù)量,可以掌握細(xì)胞生長的情況。同時,細(xì)胞計(jì)數(shù)也是衡量不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞生長情況的重要指標(biāo)之一。那么你知道細(xì)胞計(jì)數(shù)通用步驟有什么嗎?有何注意事項(xiàng)呢?讓我們一起來看看吧!
一、細(xì)胞計(jì)數(shù)的通用方法
1. 以貼壁生長的細(xì)胞為例,消化后的細(xì)胞充分重懸吹散,取一部分轉(zhuǎn)移至干凈的EP管內(nèi),例如1mL;
2. 使用酒精棉球輕輕擦拭計(jì)數(shù)板表面和蓋玻片,把后者的邊緣微微濕潤,然后小心蓋在計(jì)數(shù)板的正中間,邊緣要能覆蓋住計(jì)數(shù)板上的凹槽;
3. 將剛才轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)的細(xì)胞懸液再次進(jìn)行重復(fù)吹打,直到成為單細(xì)胞懸液,然后吸20uL懸液出來;
4. 將移液器吸頭抵在蓋玻片的上邊緣或下邊緣,然后緩緩打出液體,此時液體會因?yàn)楹缥饔帽晃肷w玻片和計(jì)數(shù)板之間的空隙內(nèi);
5. 調(diào)整顯微鏡,使用10倍物鏡觀察,此時,視野內(nèi)看到的畫面應(yīng)該如下圖所示的中間圓形的紅色區(qū)域;
6. 接下來,要計(jì)算圖中藍(lán)色區(qū)域的25個格子內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),這一塊區(qū)域的總面積是1mm2;
7. 計(jì)算出總數(shù)后,按照下方公式進(jìn)行計(jì)算,得到的結(jié)果就是細(xì)胞濃度,單位是個/mL
「25個格子內(nèi)的細(xì)胞總數(shù) x 10,000 = 細(xì)胞濃度」
8. 進(jìn)一步計(jì)算,可以得到細(xì)胞總數(shù)。
「重懸細(xì)胞的培養(yǎng)基體積 x 細(xì)胞密度 = 細(xì)胞總數(shù)」
二、血球計(jì)數(shù)板的注意事項(xiàng)
1. 細(xì)胞懸液的制備:需要將細(xì)胞懸液che底吹散為單細(xì)胞懸液,否則大量細(xì)胞團(tuán)塊的存在會讓細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果有偏差;單細(xì)胞懸液準(zhǔn)備好后,應(yīng)立即往下操作,而不能等,否則細(xì)胞又會慢慢聚集沉降成團(tuán);
2. 計(jì)數(shù)階段:有的細(xì)胞會剛好落在計(jì)數(shù)板小方格的線上,此時,要遵循數(shù)左不數(shù)右,數(shù)上不數(shù)下的原則進(jìn)行計(jì)數(shù);
3.細(xì)胞太多或太少:如果數(shù)完25個格子,總數(shù)在200-500之間(圖a),可以繼續(xù)往下?lián)Q算;
如低于200,則應(yīng)該把整個懸液區(qū)域一起計(jì)數(shù)(圖b),然后得數(shù)乘以1111得到細(xì)胞濃度;
如果大于500,則應(yīng)該重新計(jì)數(shù),但只計(jì)算25個放個內(nèi)的單條對角線上的5個格子的總數(shù)(圖c),然后乘以50,000得到細(xì)胞濃度;
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