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支原體污染的檢測(cè)方法有哪些?

 更新時(shí)間:2023-10-18    點(diǎn)擊量:618

支原體污染一般在顯微鏡下不可見,很難察覺,但細(xì)胞會(huì)受到極大的損傷,主要通過以下途徑影響細(xì)胞生長及功能。那么支原體污染的檢測(cè)方法有哪些呢?讓我們一起來看看吧!

一、分離培養(yǎng)法

檢測(cè)方法:將待檢樣品接種到適合支原體生長的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中,如有支原體污染,液體培養(yǎng)基顏色會(huì)改變,固體培養(yǎng)基將會(huì)有菌落生長。

優(yōu)點(diǎn):該方法被稱為支原體培養(yǎng)法的金標(biāo)準(zhǔn),可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體。

缺點(diǎn):支原體生長到一定數(shù)量才能判斷是否有污染,檢測(cè)時(shí)間長,無法實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的快速檢測(cè)

二、原位染色法

檢測(cè)方法:通過染色試劑(如DAPI、Hoechst 等)對(duì)待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察待測(cè)樣品的熒光判斷支原體污染。

優(yōu)點(diǎn):可清晰直觀的看到支原體微粒。

缺點(diǎn):死亡細(xì)胞釋放的DNA也會(huì)被染色,在支原體輕度污染時(shí),較難判斷是否有支原體污染。

三、化學(xué)發(fā)光法

檢測(cè)方法:利用支原體te有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),通過比較檢測(cè)試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn):檢測(cè)快速,僅需15min即可完成檢測(cè)。

缺點(diǎn):該方法只能檢測(cè)活的支原體,如果支原體死亡,將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。

四、探針法qPCR

檢測(cè)方法:設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針,通過探針法qPCR高靈敏檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞等生物材料中是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,檢測(cè)快速,可一次性檢測(cè)大量樣品,PCR擴(kuò)增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn):該方法靈敏度很高,因此對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較為苛刻,且需要精密的qPCR儀器。

五、等溫?cái)U(kuò)增變色法

檢測(cè)方法:通過設(shè)計(jì)4-6對(duì)特異性引物,在一定的恒定溫度下,通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進(jìn)行核酸的快速擴(kuò)增,并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。

優(yōu)點(diǎn):不需要反復(fù)的升溫和降溫,不需要精密的儀器,在恒定的溫度下即可對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,無需電泳分析,通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。

缺點(diǎn):對(duì)引物要求較高,需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物,且擴(kuò)增產(chǎn)物不能用于測(cè)序。

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