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022-66387942離心柱上有硅膠濾膜,在高鹽低pH條件下,核酸能結(jié)合到硅膠膜上,而蛋白質(zhì)和其他代謝產(chǎn)物被洗脫;后續(xù)改變反應(yīng)條件到低鹽高pH來洗脫純化DNA。用離心柱法來提取DNA,得到的DNA質(zhì)量好,純度和濃度較高。那么離心柱法提取DNA的實驗步驟與注意事項有哪些呢?讓我們一起來看看吧!
一、實驗步驟
1. 平衡液預處理
取一個新的吸附柱放在收集管中,懸空加入100μL的平衡液至離心柱中,12000rpm離心1min,倒掉收集管中的廢液,將離心柱放回收集管中,備用。
2. 處理材料
(1)如提取材料為血液,可直接使用200μL新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液,不足200μL可加緩沖液1補足;
(2)貼壁培養(yǎng)的細胞和動物組織應(yīng)先處理為細胞懸液,然后10000rpm離心1min,棄上清,加200μL緩沖液,振蕩至che底懸??;
3. 加入蛋白酶K,混勻
(1)提取血液和細胞基因組時,只需加入蛋白酶K混勻,即可繼續(xù)進行下一步;
(2)提取組織基因組時,加入蛋白酶K混勻,需在56℃放置,直至組織溶解,12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠,再進行下一步驟。
4. 加入200μL緩沖液2,充分顛倒混勻,70℃放置10min,溶液應(yīng)變清亮,12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
5. 加入200μL無水乙醇,充分振蕩混勻15s,此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀,12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
6. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm離心30s,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管中。
7. 向吸附柱中加入500μL緩沖液3(注意:使用前請確保已加入無水乙醇?。?,12000rpm離心30s,倒掉廢液,將吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入600μL漂洗液(注意:使用前請確保已加入無水乙醇?。?,離心30s,倒掉廢液,將吸附柱放入收集管中。
9. 重復操作步驟8。
10. 將吸附柱放回收集管中,12000rpm離心2min,盡量去除漂洗液,將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,以che底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11. 將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位加50~100μL洗脫液,室溫放置3~5min,12000rpm離心2min;將得到的溶液重新放回吸附柱中,室溫放置2分鐘,12000rpm離心2min,收集DNA溶液。
12. DNA可以存放在2~8℃,若要長時間存放,可以放置在-20℃。
二、注意事項
1. 所有的離心步驟均在室溫完成,均使用臺式離心機;
2. 使用前確保緩沖液3和漂洗液中預先加入無水乙醇;
3. 實驗前將需要的水浴先預熱到70℃?zhèn)溆茫?/p>
4. 第10步,要讓漂洗液揮發(fā)干凈,否則會影響后續(xù)的實驗;
5. 樣品需要避免反復凍融,否則會影響DNA的得率。
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