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022-66387942Trizol法是目前普遍使用的RNA提取方法,那么Trizol法提取RNA有哪些注意事項(xiàng)和常見問(wèn)題呢?讓我們一起來(lái)看看吧!
一、Trizol法提取RNA的注意事項(xiàng)
在使用TRIZOL的時(shí)候要帶手套和眼罩,避免接觸到皮膚和衣服,使用化學(xué)通風(fēng)櫥,防止蒸汽吸入。
從少量樣品(1-10mg組織或102-104細(xì)胞)中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來(lái),糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成,也不影響PCR反應(yīng)。
勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī),2600×g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量:1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為:
肝和脾6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細(xì)胞8-15μg ,成纖維細(xì)胞5-7μg。
二、Trizol法提取RNA的常見問(wèn)題
1. 得率低
(1)樣品裂解或勻漿處理不che底
(2)RNA沉淀未wan全溶解
2. OD260/OD280<1 .65
(1)檢測(cè)吸光度時(shí),rna樣品沒(méi)有溶于水,而溶于了TE中
(2)樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少
(3)勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘
(4)吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相
(5)RNA沉淀未wan全溶解。
3. RNA降解
(1)組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍
(2)待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
(3)細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度
(4)溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理
(5)電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5
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