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免疫組化實驗流程有哪些?

 更新時間:2023-10-09    點擊量:465

 你知道免疫組化實驗流程有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、樣品制備

1. 組織固定:根據(jù)要求收集人或動物的組織用于IHC分析,沖洗并用固定劑(一般用甲醛)進行固定

2. 組織包埋:將經(jīng)甲醛固定的組織嵌入石蠟,以長期保持其天然形狀和組織結(jié)構(gòu)

3. 切片安裝:將組織樣品在切片機上切片,并轉(zhuǎn)移至載玻片上干燥保持其形態(tài)

4. 脫蠟水化:因切片上的石蠟會妨礙染色,所以需將切片上的石蠟溶出,并水化。脫蠟或水化不全容易造成非特異性背景著色(一般的脫蠟水化步驟是:將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無水乙醇5min-90%無水乙醇5min-80%無水乙醇5min-70%無水乙醇5min-50%無水乙醇5min-蒸餾水5min×3,進行脫蠟水化)。

5. 抗原修復:由于組織在甲醛固定過程中,蛋白之間發(fā)生了交聯(lián)及醛基的封閉從而掩蓋抗原決定簇??梢酝ㄟ^高壓加熱修復抗原,使細胞內(nèi)抗原決定族暴露,從而提高抗原檢測率。

6. 非特定位點封閉:為了防止一抗的非特異性結(jié)合造成假陽性,可以選用BSA、羊血清等封閉非特異性結(jié)合位點。封閉血清來源一般與二抗保持一致,室溫封閉10-30min。

二、樣品染色

1. 一抗、二抗孵育:抗體孵育時間、溫度及濃度等因素對染色結(jié)果都存在很大影響。在4℃下反應緩慢,背景較淺;37℃反應較快時間較短;而室溫介于兩者之間,選擇室溫有利于實驗的進行。二抗一般室溫孵育30min

2. 底物顯色:基于與酶綴合的二抗,抗原通過生色或熒光方式直接檢測。

3. 復染封片:組化染色后進行復染可以襯托出組織形態(tài)結(jié)構(gòu),常用的復染劑有蘇木精、曙紅、甲基綠、DAPIHoechst熒光染色。觀察結(jié)束后使用中性樹膠進行封片,可以長久保存。

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