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022-66387942產(chǎn)品名稱:abcam重組Drebrin抗體[EPR12634] (ab178408)現(xiàn)貨供應(yīng)
產(chǎn)品貨號:ab178408
產(chǎn)品品牌:abcam
實驗流程:
蛋白質(zhì)印跡實驗方案:
1. 樣品裂解
l 從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備裂解物
(1) 將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在冰上,用冰冷的PBS清洗細(xì)胞。
(2) 吸出 PBS,然后加入冰冷的裂解緩沖液(每 10 mL7細(xì)胞/100 mm 培養(yǎng)皿/150 cm2瓶;每 5x10 0.5 mL6細(xì)胞/60 mm 培養(yǎng)皿/75 cm2燒瓶)。
(3) 使用冷塑料細(xì)胞刮刀從培養(yǎng)皿上刮下貼壁細(xì)胞,然后輕輕地將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的微量離心管中?;蛘撸谖⒘侩x心管中的裂解緩沖液中重懸之前,可以胰蛋白酶消化并用PBS洗滌細(xì)胞。
(4) 在 4°C 下保持恒定攪拌 30 分鐘。
(5) 在4°C的微量離心機(jī)中離心細(xì)胞懸液。 您可能需要根據(jù)細(xì)胞類型改變離心力和時間;指南是在 14,000–17,000 g 下 5 分鐘,但這必須為您的實驗確定(白細(xì)胞需要非常輕的離心)。
(6) 輕輕地從離心機(jī)中取出試管并放在冰上,吸出上清液并放入保持在冰上的新鮮試管中,然后丟棄沉淀。
l 從組織中制備裂解物
(1) 用干凈的工具解剖感興趣的組織,最好在冰上解剖,并盡快防止蛋白酶降解。
(2) 將組織放入圓底微量離心管或Eppendorf管中,并浸入液氮中以快速冷凍。將樣品儲存在 -80°C 以備后用,或放在冰上立即均質(zhì)化。對于~5mg組織,向試管中快速加入~300μL冰冷裂解緩沖液,用電動均質(zhì)器勻漿,用另一個2×200μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次,然后在4°C下保持恒定攪拌2小時(例如,放在冰箱中的軌道振蕩器上)。裂解緩沖液的體積必須根據(jù)存在的組織量來確定;蛋白質(zhì)提取物不應(yīng)太稀釋,以免蛋白質(zhì)損失和大量樣品上樣到凝膠上。濃度下限為 0.1 mg/mL,最佳濃度為 1–5 mg/mL。
(3) 在微量離心機(jī)中以 14,000–17,000 g 在 4°C 下離心 5–10 分鐘。輕輕地從離心機(jī)中取出試管,放在冰上,吸出上清液,然后放入保持在冰上的新鮮試管中;丟棄顆粒。
2. 樣品制備
(1) 除去少量裂解物以進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定。確定每種細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度。
(2) 確定要加載多少蛋白質(zhì)并加入等體積的 2X Laemmli 樣品緩沖液。
(3) 我們建議使用以下方法對樣品進(jìn)行還原和變性,除非在線抗體數(shù)據(jù)表表明應(yīng)使用非還原和非變性條件。
(4) 為了減少樣品和變性,將每個細(xì)胞裂解物在樣品緩沖液中在100°C下煮沸5分鐘。裂解物可以等分并儲存在 -20°C 以備將來使用。
3. 抗體染色
(1) 使用封閉緩沖液在室溫下封閉膜1小時或在4°C下過夜。
(2) 在封閉緩沖液中用適當(dāng)稀釋的一抗孵育膜。我們建議在 4°C 下孵育過夜;其他條件可以優(yōu)化。
(3) 用三次TBST洗滌膜,每次5分鐘。
(4) 在室溫下,在封閉緩沖液中用推薦的偶聯(lián)二抗稀釋液孵育膜1小時。
(5) 用三次TBST洗滌膜,每次5分鐘。
(6) 對于信號開發(fā),請遵循套件制造商的建議。去除多余的試劑并用透明保鮮膜覆蓋膜。
(7) 使用用于化學(xué)發(fā)光的暗室顯影技術(shù)或用于比色檢測的普通圖像掃描方法獲取圖像。
相關(guān)文獻(xiàn):
[1] Brezovakova V et al. Astrocytes Derived from Familial and Sporadic Alzheimer's Disease iPSCs Show Altered Calcium Signaling and Respond Differently to Misfolded Protein Tau. Cells 11:N/A (2022).
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貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
ab178408 | 重組Drebrin抗體[EPR12634] | 40 µl |
100 µl |
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