細(xì)胞克隆形成實驗是用來檢測細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對殺傷因素敏感性等項目的重要技術(shù)方法?？寺⌒纬梢罁?jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同，可分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。那么你知道這兩種細(xì)胞克隆實驗的操作方法嗎？讓我們一起來看看吧！

一、平板克隆

1. 所需材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（根據(jù)細(xì)胞選擇適用種類）

胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素溶液（100X）、多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染液、Giemsa染液、

2. 實驗步驟

（1）6孔板

1）將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后，wan全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并計數(shù)；

2）細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種400-1,000個細(xì)胞/孔（根據(jù)細(xì)胞生長情況確定，一般為700個細(xì)胞/孔）;

3）繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)；

4）克隆完成后，在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

5）每孔加入結(jié)晶紫染液1ml，染細(xì)胞10-20 min；

6）PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照（分別對整個六孔板及每個孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）。

（2）平皿

1）取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在wan全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）中備用。

2）將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組5個平行樣。每組細(xì)胞每皿分別接種100個細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。

3）置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

4）當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5）加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6）去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘

7）用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8）將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

3. 數(shù)據(jù)分析

顯微鏡下觀察陽性克隆，即每個克隆>50個細(xì)胞，相機(jī)拍照，數(shù)克隆數(shù)（大小約在0.3-1.0 mm）計算克隆形成率，并統(tǒng)計克隆大小。

二、軟瓊脂克隆形成

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗Anchorage-independent assay，利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。
某些惡性腫瘤細(xì)胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下也能增殖，進(jìn)而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

1. 實驗步驟

1）配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會凝固；

2）將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3）將制備好的單細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次；

4）根據(jù)細(xì)胞的生長速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個克隆>50個細(xì)胞，顯微鏡拍照。若拍整個孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色，37°C過夜，拍照。

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