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022-66387942聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物中通常會含有過量的引物、dNTP、酶等,這些會對后續(xù)核酸序列測定、酶切、載體構(gòu)建等產(chǎn)生影響,通過PCR純化回收可獲取純的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。那么PCR純化回收的步驟與注意事項(xiàng)有哪些呢?讓我們一起來看看吧!
一、步驟
1.在紫外投射儀或凝膠成像儀上,用刀片切取包含目的條帶的瓊脂糖凝膠并稱重;
2.一般以0.1g膠加入100μl溶膠液的比例(具體根據(jù)試劑盒說明添加),按凝膠實(shí)際重量加入溶膠液,水浴鍋中55℃溶膠(期間可緩慢震動Ep管,將膠溶解wan全);
3.回收試劑盒中會配有回收柱和廢液管,將溶解好的溶液加入回收柱中,并將回收柱套入2ml廢液管中;
4.12000r/min離心30-60s,去除廢液;
5.將500μl漂洗液加入回收柱,并將回收柱重新套入2ml廢液管中,12000r/min離心60-90s,去除廢液;
6.重復(fù)漂洗一次去除廢液;
7.12000r/min離心2min,將回收柱套入高壓滅菌后的1.5mlEp管中;
8.向回收柱正中央的濾膜上滴加20-30μl洗脫buffer或高壓滅菌ddH2O,靜置5-15min;
9.12000r/min離心90-120s;
10.將1.5mlEp管中的回收產(chǎn)物再次滴入到回收柱中央的濾膜上,或向?yàn)V膜中央再加10μl洗脫buffer或高壓滅菌ddH2O,繼續(xù)靜置5-15min;
11.12000r/min離心120s,1.5mlEp管中收集到的溶液即為純化回收的PCR產(chǎn)物。
二、注意事項(xiàng)
1. 切取的包含目的條帶的瓊脂糖凝膠需稱重,并按照試劑盒說明要求按比例添加溶膠液;
2. 溶膠需充分;
3. 回收管、ddH2O要提前高壓滅菌;
4. 為盡量提高回收率可以將回收產(chǎn)物再次過柱、離心。
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